小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒

小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒

 (用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗小鼠 2,3-DPG 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 2,3-DPG与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠2,3-DPG，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，2,3-DPG浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中2,3-DPG浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

准备试剂与收集血样

1.          10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

2.          收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。

3.          标准品液配制：设标准管7管，每管加入标本稀释液100ul。在第一管中加入120mmol/L的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出100ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出100ul弃去。第七管为空白对照。加上原液管总共八管。

4.      洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.          加样：每孔各加入标准品或待测样品5ul。将反应板振荡60秒

2.          每孔加入第一抗体工作液45ul(空白除外)，盖紧封板膜以避免交叉污染。将反应板置振荡器（400-500rpm）室温（18-25℃）120分钟。

3.          洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

4.          每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。

5.          洗板：同前。

6.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

7.          每孔加入100ul终止液混匀。

8.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.          所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。

2.          以标准品120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0 mmol/L为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。

3.          根据样品OD值计算出相应2,3-DPG含量。软件可以向本公司邮件索取。

试剂盒性能

         1.   灵敏度：最小的2,3-DPG 检测浓度小于1mmol/L。

2.    特异性：可同时检测重组或天然的小鼠2,3-DPG。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。

3.    重复性：板内、板间变异系数均小于10％。

注意事项

         1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

         3.   检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

         4.   试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

         5.   说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！

 6.   本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！